Desarrollo de cultivos iniciadores cerveceros basados en levaduras nativas para la producción de bebidas fermentadas con alto valor agregado

Abstract

El continuo crecimiento en el mercado de la cerveza artesanal, y el aumento del interés y las exigencias de los consumidores, han orientado los esfuerzos del sector hacia la producción de cervezas diferenciales e innovadoras. En este punto, las levaduras no convencionales, distintas de las levaduras cerveceras tradicionales S. cerevisiae (ale) y S. pastorianus (lager), han cobrado gran protagonismo como herramientas para el desarrollo de nuevos productos. De gran interés resulta la especie criotolerante S. eubayanus, aislada por primera vez en la Patagonia Argentina e identificada como uno de los parentales de la especie híbrida S. pastorianus (levadura lager). Este trabajo buscó contribuir al conocimiento sobre el comportamiento fermentativo de S. eubayanus, desarrollar cultivos iniciadores aptos para su aplicación en la industria cervecera y evaluar sus estrategias de aplicación a escala productiva. Inicialmente, cinco cepas de S. eubayanus (representativas de las cinco subpoblaciones estructuradas geográficamente) fueron ensayadas en fermentaciones a escala laboratorio evaluándose su capacidad fermentativa (velocidad de fermentación, atenuación, perfil de azúcares consumidos) y su perfil organoléptico (ésteres, alcoholes superiores, fenoles, evaluación sensorial). Las diferentes características fermentativas observadas y la producción diferencial de compuestos volátiles entre las cepas demostraron variabilidad fenotípica intraespecífica. Por su parte, la cepa CRUB 1568T fue seleccionada debido a su buen rendimiento fermentativo, moderada producción de los fenoles 4-vinilguaiacol y 4-vinilfenol, y su aporte de los ésteres frutados hexanoato y octanoato de etilo. A partir de la cepa seleccionada, se buscaron establecer las condiciones de propagación para el desarrollo de cultivos iniciadores para la producción de cerveza. Se evaluaron distintas técnicas para la determinación de la viabilidad y vitalidad de los inóculos, seleccionándose el método de tinción con violeta de metileno alcalino y las fermentaciones a escala laboratorio, respectivamente. Se seleccionó un medio de cultivo a base de extracto de malta comercial, cuya composición fue optimizada evaluando 9 factores con dos niveles, a través de un diseño experimental del tipo Plackett-Burman. Dos factores mostraron influencia significativa sobre la producción de biomasa (extracto de levadura y peptona ácida de caseína), y fueron posteriormente optimizados mediante un Diseño Central Compuesto, a través de la Metodología de Superficie Respuesta. Con el medio de cultivo optimizado (medio extracto de malta con 0,31 % p/v de extracto de levadura y 0,12 % p/v de peptona ácida de caseína) logró obtenerse una producción de biomasa igual a la del medio sin optimizar (12 g/L), pero con una reducción de costos del 40 %. Por último, se realizó el escalado de la propagación a 20 L, obteniéndose cultivos de S. eubayanus puros y de calidad, de tamaño suficiente como para inocular fermentadores de hasta 700 L. Previo al traspaso de los cultivos iniciadores al sector cervecero, se evaluó la interacción de S. eubayanus con el lúpulo. Para ello, se estudió el comportamiento fermentativo de la cepa CRUB 1568T en mostos sin lupular y lupulados, así como el impacto de la levadura en el amargor medido (IBU, por sus siglas en inglés) y en la percepción sensorial del amargor. S. eubayanus presentó tolerancia a los compuestos del lúpulo (20 y 60 IBUs), observándose incluso una velocidad de fermentación aumentada en mostos lupulados (del 34 % y 62 %, respectivamente). Por su parte, los IBUs obtenidos para cervezas fermentadas con S. eubayanus resultaron superiores que para las cepas industriales (18 % mayor), siendo esta diferencia notoria sensorialmente e incluso percibida como un amargo áspero (harsh). Estos resultados permiten adoptar criterios para su aplicación y predecir adecuadamente el perfil final de las cervezas producidas con esta levadura. Posteriormente, S. eubayanus CRUB 1568T fue ensayada a escala semi-piloto de 20-40 L en mosto cervecero, obteniéndose un comportamiento similar a lo observado a escala laboratorio. Sin embargo, cuando esta levadura salvaje se aplicó a escala productiva (1000-1500 L), mostró un bajo rendimiento de fermentación. Las fermentaciones se completaron en 20 días (prácticamente el doble de tiempo que a escala laboratorio y semi-piloto) con una atenuación promedio del 30 % (la mitad de lo observado previamente). Se decidió evaluar si un aumento en el suministro de oxígeno durante la fermentación podría ayudar a mejorar el rendimiento fermentativo a mayor escala. Se encontró una mejora en la eficiencia de la fermentación aplicando distintos regímenes de oxigenación, llegando a obtenerse fermentaciones completas en 5-7 días, con niveles de atenuación del 60 %. Este trabajo fomenta el uso de levaduras no convencionales en la elaboración de cerveza. La selección de levaduras autóctonas del ambiente representa un valioso recurso, no sólo para el desarrollo de cervezas innovadoras con mayor diferenciación productiva, sino que abre la posibilidad de otorgar un carácter regional al producto, con una consecuente mejora en la competitividad para el sector. Encontramos que la aplicación de estas levaduras en la industria requiere de un manejo diferente al de las levaduras cerveceras tradicionales, abriéndose así un punto de partida para continuar con investigación y experimentación en relación a las diferentes estrategias que se pueden abordar.

The continuous growth in the craft beer market, and the increased interest and demands of consumers, have directed the efforts of brewers towards the production of differential and innovative beers. In this sense, non-conventional yeasts - other than the traditional domesticated ale (Saccharomyces cerevisiae) and lager (Saccharomyces pastorianus) yeasts - have gained attention as tools for new product development. Of great interest is the cryotolerant species S. eubayanus, isolated for the first time in Patagonia (Argentina) and identified as one of the parents of the hybrid species S. pastorianus (lager yeast). This work sought to contribute to the knowledge about the fermentative behavior of S. eubayanus, develop starter cultures suitable for the brewing industry, and evaluate different strategies for its application on a productive scale. First, five strains of S. eubayanus (representative of the five geographically structured subpopulations) were tested in laboratory-scale fermentations, evaluating their fermentation performance (fermentation rate, attenuation, sugars consumption) and their organoleptic profile (esters, higher alcohols, phenols, sensory evaluation). The different fermentative characteristics observed and the differential production of volatile compounds between the strains demonstrated intraspecific phenotypic variability of the species. The strain CRUB 1568T was selected due to its good fermentation performance, moderate production of phenols (4-vinylguaiacol and 4-vinylphenol), and its contribution of the fruity ester’s ethyl hexanoate and ethyl octanoate. From the selected strain, it was sought to establish the propagation conditions for the development of starter cultures for brewing. Different techniques were evaluated to determine the viability and vitality of the biomass produced, selecting the alkaline methylene violet staining method and laboratory-scale fermentations, respectively. A culture medium based on commercial malt extract was selected and optimized by evaluating 9 factors, with two levels for each factor, through an experimental Plackett-Burman design. Two factors showed significant influence on biomass production (yeast extract and acid casein peptone), and were later optimized by a Central Composite Design, through Response Surface Methodology. With the optimized culture medium (malt extract medium with 0.31 % w/v of yeast extract and 0.12 % w/v of acid casein peptone) it was possible to obtain a biomass production equal to that of the non-optimized medium (12 g/L), but with a 40 % a cost reduction. Finally, the propagation was scaled-up to 20 L, being able to obtain pure and quality S. eubayanus cultures, with adequate cell density to inoculate fermenters of up to 700 L. Prior to transfer the starter cultures to the brewing industry, the interaction of S. eubayanus with hops was evaluated. For this, the fermentation performance of S. eubayanus CRUB 1568T in hopped and unhopped wort was studied, as well as the impact of the yeast on the measured (IBU) and sensory perception of bitterness. S. eubayanus showed tolerance to hop compounds (20 and 60 IBUs), presenting even an increased fermentation rate in hopped worts (34 % and 62 %, respectively). On the other hand, the IBUs obtained for beers fermented with S. eubayanus were 18 % higher than for the industrial strains, with this difference being notorious sensorially and even perceived as a harsh bitterness. These results allow us to adopt criteria for the application of S. eubayanus in brewing, and adequately predict the final profile of the beers produced with this yeast. Subsequently, S. eubayanus CRUB 1568T was tested on brewing wort at a semi-pilot scale (20-40 L), observing a similar behavior to that obtained in the laboratory. Nevertheless, when this wild yeast was applied on a productive scale (1000-1500 L), it showed a poor fermentation performance. Fermentations were completed in 20 days (almost twice as long as laboratory and semi-pilot scales) with an average attenuation of 30 % (half of what was previously observed). It was decided to test whether an increase in oxygen supply during fermentation could help improve fermentation performance on a larger scale. An improvement in fermentation performance was found by applying different oxygenation regimens, achieving complete fermentations in 5-7 days, with attenuation levels of 60 %. This work encourages the use of non-conventional yeasts in brewing. The selection of native yeasts from the environment represents a valuable resource, not only for the development of innovative beers with greater productive differentiation, but also opens the possibility of conferring regional character to the product, with a consequent improvement in competitiveness. It was certainly found that the application of these yeasts in the industry requires different handling than traditional brewing yeasts, and opens a starting point for research and experimentation in relation to the different strategies that can be addressed.