Identificación de biomarcadores moleculares de exposición crónica a hidrocarburos en el crustáceo de agua dulce Hyalella curvispina como herramientas para la evaluación ambiental en zonas de explotación hidrocarburífera

Abstract

El petróleo crudo es una mezcla compleja de hidrocarburos alifáticos y aromáticos con cantidades variables de azufre, nitrógeno, oxígeno y trazas de metales como níquel, vanadio y cromo. La demanda de hidrocarburos de petróleo crudo genera preocupación mundial debido a la contaminación, especialmente en ecosistemas acuáticos. Estudios sobre contaminación con petróleo crudo han revelado que su toxicidad es causada principalmente por la fracción acomodada en agua de petróleo (WAF). Al igual que con otros xenobióticos, los efectos tóxicos de la WAF en los organismos se manifiestan primero a nivel bioquímico-molecular y luego se transmiten a los siguientes niveles de organización biológica. Entre los organismos bentónicos de agua dulce, los anfípodos Hyalella curvispina son considerados importantes bioindicadores de la calidad del ecosistema acuático por su sensibilidad a diferentes xenobióticos. La explotación de los recursos energéticos es la principal actividad económica en la provincia de Neuquén. A pesar de las regulaciones y programas de monitoreo, se han detectado hidrocarburos de petróleo, como naftaleno y pireno, en muestras de agua y sedimentos de diferentes sitios de Neuquén. Por lo tanto, los objetivos de este trabajo fueron (i) caracterizar la composición de hidrocarburos de WAF y su disipación en el tiempo (ii) evaluar los efectos subletales producidos por la exposición a WAF en dos poblaciones de H. curvispina. La WAF se obtuvo a partir de petróleo crudo extraído del pozo Chachahuen, ubicado en la cuenca neuquina. Se trabajó con anfípodos de H. curvispina colectados en el lago Los Barreales (LB) y Arroyo Durán (AD), éste último con antecedentes de contaminación por hidrocarburos. Se evaluó el efecto de la exposición a 0,0014 mg/L y 0,35 mg/L de WAF durante 6, 24 y 48 h en el contenido de glutatión (GSH), y las actividades enzimáticas de glutatión S-transferasa (GST), catalasa (CAT) y citocromo P450 monooxigenasa (CYP450). La concentración total de hidrocarburos en la WAF fue de 2,50 mg/L y sus principales componentes fueron C9-C36 n-alcanos (TPHs). En menor proporción se determinaron hidrocarburos aromáticos de un solo anillo (BTEX) y bajas concentraciones de hidrocarburos poliaromáticos (PAHs), particularmente naftaleno. Se ajustaron modelos exponenciales simples a los datos de disipación de cada componente de WAF. El tiempo de vida media (t½) de los TPHs fue 71 ± 32 h. Los t½ estimados para tolueno (65 ± 11 h), benceno (76 ± 16 h) y etilbenceno (88 ± 19 h) fueron menores que el t½ de m- y p-xileno (128 ± 25 h) y el o-xileno (217 ± 45 h), éste último significativamente diferente de los otros componentes. El t½ de naftaleno no fue estimado dado que a las 6 h su concentración estaba por debajo de los límites de detección. Las muestras de LB y AD mostraron valores de temperatura y pH similares. La conductividad eléctrica en AD fue aproximadamente 7 veces mayor que en LB, mientras que el oxígeno disuelto fue menor. La concentración de hidrocarburos en sedimentos fue 27 veces mayor en AD respecto a la determinada en LB, indicando que el área estaba muy contaminada con n-alcanos. Sólo se determinaron hidrocarburos en las muestras de agua del sitio AD. Las concentraciones de BTEX y PAHs estuvieron bajo los niveles de detección en ambos sitios. Tanto en las muestras de agua como de sedimentos de AD, las concentraciones de plaguicidas analizados estuvieron bajo los niveles de detección. La toxicidad aguda y crónica a WAF en anfípodos de LB fue de 0,33 mg/L y 0,018 mg/L, respectivamente. Por otro lado, no se registró mortalidad de anfípodos recolectados en AD tanto en exposiciones agudas como en crónicas a WAF (2,50 mg/L). Los anfípodos provenientes de AD presentaron, respecto a los organismos de LB, una significativa disminución en el contenido de GSH y en la actividad basal GST y un significativo aumento en actividad CAT y CYP450. La respuesta a la exposición a WAF fue diferente en ambas poblaciones. En anfípodos provenientes de LB, tanto el contenido de GSH como la actividad de CAT y CYP450 aumentaron en forma significativa a su respectivo control en todos los tiempos de exposición a WAF evaluados. Por otro lado, la actividad GST en esta población disminuyó de forma significativa luego de 24 y 48 h de exposición a WAF. En la población AD se observó un aumento significativo en el contenido de GSH a las 6 h de exposición a WAF. Por el contrario, la actividad CAT disminuyó en forma significativa a las 24 h de exposición y las actividades GST y CYP450 no mostraron diferencias significativas respecto a su control en ninguno de los tiempos de exposición. El análisis de la distribución de frecuencias de la actividad CYP450 mostró que el 100% de los anfípodos de AD presentaron actividades superiores al intervalo de confianza superior de la media (IC95%) de LB. Diferentes isoformas de esterasas (EST) fueron identificadas en anfípodos de las poblaciones AD y LB. A través de estudios moleculares se amplificaron fragmentos de alrededor de 710 pb del gen CYP450 en anfípodos de LB controles y expuestos a WAF. A partir de la curva de distribución de sensibilidad de especies (SSD) a WAF en organismos acuáticos se determinó que 0,46 mg/L afectaría al 10% de las especies acuáticas, incluidos los anfípodos de LB. Los resultados de este trabajo de tesis señalan que los t½ de los componentes de WAF preparada con petróleo de la región variaron entre 65-200 h. El valor de 96 h-CL50 de H. curvispina de LB, comprendido dentro del percentil 10 estimado a partir de la SSD, indica su alta susceptibilidad a WAF. Sin embargo, la ocurrencia de tolerancia a WAF en los anfípodos de AD indicaría su capacidad de adaptación a ambientes contaminados a través del aumento de actividad del sistema de detoxificación. Los parámetros bioquímicos estudiados podrían ser utilizados como biomarcadores de contaminación por petróleo. La SSD permitió establecer niveles de referencia de toxicidad para WAF.