Prospección de microorganismos de degradadores de flavonoides: diglicosidasas, aspectos fisiológicos y biotecnológicos

Abstract

Microorganismos como levaduras y bacterias son una fuente inexplorada de diglicosidasas. Treinta y tres cepas fueron seleccionadas por su capacidad de crecer en medios con flavonoides diglicosilados (hesperidina y/o rutina) como principal fuente de carbono. Se exploró la capacidad de escindir el residuo disacáridico en un solo paso, sin embargo la estrategia más común fue la vía de dos pasos (actividades β-D-glucosidasa y α-L-ramnosidasa). Solo las bacterias Actinoplanes missouriensis, Actinoplanes liguriae y la levadura Cryptococcus carnescens exhibieron actividad desglicosilante de hesperidina en varios órdenes de magnitud mayor que las actividades monoglicosidasa. Se seleccionó la cepa A. missouriensis se cultivó en un biorreactor y se detectó una actividad diglicosidasa máxima a los cuatro días (27,7 U/l). También se detectaron actividades monoglicosidasas en el medio de crecimiento (0,11 U/l de α-L-ramnosidasa y 0,42 U/l β-D-glucosidasa). La enzima se purificó a homogeneidad en tres etapas, el zimograma reveló una banda positiva (Rf 0,45) para ambos sustratos, MU-β-glucósido y MU-β-rutinósido. Sin embargo, se confirmó por NMR H1 y C13 el disacárido rutinosa como el producto principal de hidrólisis de hesperidina. El gen que codifica la 6-O-α-L-ramnosil-β-D-glucosidasa se identificó en la secuencia del genoma de A. missouriensis 431T (número de acceso GenBank BAL86042.1) y se expresó funcionalmente en Escherichia coli. La proteína recombinante hidroliza hesperidina y hesperidina metilchalcona, pero no rutina, lo cual indica su especificidad para los flavonoides 7-O-rutinosilados. La proteína se clasificó dentro de las glicosil-hidrolasas de la familia 55 (GH55) en contraste con las diglicosidasas eucariotas conocidas, que pertenecen a GH1 y GH5. Estos hallazgos demuestran que organismos distintos de plantas y hongos filamentosos pueden contribuir a una expansión del conocimiento de diglicosidasas. Además, se describe el clonado y expresión de 6-O-α-L-ramnosil-β-D-glucosidasa de Acremonium sp. DSM24697. La expresión heteróloga de la enzima se realizó en los hospedadores E. coli y Pichia pastoris. En ambos sistemas se logró la producción de la proteína activa, sin embargo la expresada por E.coli mostró actividad hidrolítica pero no transglicosilación, mientras que la producida por la levadura mostró ambas actividades al igual que la proteína original.