Caracterización de toxinas Killer con potencial aplicación en biocontrol de levaduras contaminantes de vinos

Abstract

El deterioro microbiológico es una preocupación importante en toda la industria del vino y las herramientas de control son limitadas. El uso de las tecnologías emergentes incluye, entre otras, la utilización de toxinas killer como antagonistas biológicos que permitirán reducir la aplicación de dióxido de azufre para inhibir el crecimiento de levaduras contaminantes. Este trabajo aborda la identificación y caracterización de toxinas killer producidas por Torulaspora delbrueckii (NPCC 1033), Wickerhamomyces anomalus (NPCC 1027) y Saccharomyces eubayanus (NPCC 1302) con potencial actividad de biocontrol en cepas contaminantes de vinos. Las tres cepas de levaduras son capaces de inhibir selectivamente el crecimiento de Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens sin afectar el desarrollo de la mayoría de las cepas de S. cerevisiae que se utilizan como cultivos iniciadores del proceso de obtención del vino. Se analizaron estrategias de producción, se optimizaron los medios de cultivo y purificaron las diferentes toxinas. Las tres levaduras presentan un pico máximo de producción de toxina al inicio de la fase estacionaria de los cultivos. Las toxinas obtenidas se purificaron por filtración tangencial, luego por cromatografía de afinidad y se concentraron por membranas de corte molecular. Se obtuvieron extractos con 21,3 UA killer/mg de SeKT, 8,6 UA killer/mg de TdKT y 7,2 UA killer/mg de WaKT. La actividad killer de las tres toxinas se mantiene estable entre pH 3 y 4,5 y son sensibles a temperaturas superiores a los 26 °C. La actividad killer de las tres toxinas no es afectada por concentraciones de hasta 16% v/v de etanol, de hasta 300 g/L de glucosa y de hasta 100 ppm de dióxido de azufre. Solamente SeKT muestra una pérdida de 30 % de actividad en presencia de 160 ppm de dióxido de azufre. Se analizó la estabilidad de las toxinas en vino y en mosto. SeKT muestra mayor estabilidad en vino que en mosto, con una disminución del 20 % de su actividad a las 48 h de incubación en mosto. TdKT presenta un comportamiento similar en mosto y vino, con un 70 y 80 % de descenso a las 48 h de incubación. En el caso de WaKT, la estabilidad en mosto es muy elevada (conservando el 80 % de actividad a las 48 h) pero es mucho más sensible a la incubación en vino, con una pérdida del 80 % de actividad a las 48 h. Con el objetivo de avanzar en la caracterización bioquímica se realizó la optimización de la producción de las tres toxinas en escala de laboratorio. Se aplicaron herramientas estadísticas y de diseño experimental para llevar a cabo la optimización del medio de cultivo para la producción de SeKT, TdKT y WaKT. Se analizó la influencia en la producción de las toxinas killer de la temperatura, velocidad de agitación, agregado de tritón y glicerol al medio de cultivo GPY. Con el objetivo de maximizar la producción de las toxinas se determinaron los niveles óptimos de estos cuatro factores, se utilizó un diseño central compuesto (DCC) y se seleccionaron las 14 condiciones óptimas utilizando la metodología de superficie de respuesta. Para la producción de SeKT la condición óptima fue: 5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; para TdKT: 12,5 v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm y 13 °C; y para WaKT: 12,5 % v/v de glicerol, 0,1 % v/v de tritón, 120 rpm, 20 °C. La producción en condiciones optimizadas aumenta 18 veces la producción de SeKT, 1,6 veces la producción de TdKT y 2,3 veces para WaKT, con respecto a las condiciones sin optimizar. Se avanzó en la caracterización de los mecanismos de acción de las toxinas. Con el objetivo de determinar el receptor primario de la pared de la célula sensible, se analizó la interferencia en la actividad killer con la incubación junto a diferentes componentes de la pared celular. Las toxinas WaKT y TdKT son capaces de interactuar con los β-1,6 glucanos de la pared. Por otra parte, SeKT utiliza como receptor primario los β-1,6 glucanos y los β-1,3 glucanos. SeKT y TdKT se unen a la quitina de las células sensibles. Ninguna de las toxinas se une a las mananoproteínas. Para determinar si el mecanismo de acción de las toxinas involucra la inducción del daño a la pared celular, se determinó la actividad enzimática de las toxinas. WaKT y TdKT presentan actividad quitinasa con aumento proporcional a la actividad killer. Las tres toxinas presentan actividad β-glucanasa, con aumento proporcional a la actividad killer. Los cambios en la morfología de la pared celular de las levaduras sensibles se evidenciaron por la tinción de quitina con Calcofluor White. TdKT y WaKT inducen cambios en la morfología de la pared, mientras que SeKT no altera la integridad de la pared celular. También se estudiaron mecanismos de acción que involucran eventos relacionados con la detención del ciclo celular, inducción de muerte celular programada (apoptosis) y necrosis. Se analizó la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la morfología nuclear por microscopía de fluorescencia, como indicadores de apoptosis. SeKT provoca la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la translocación de la fosfatidilserina y la condensación de la cromatina en los núcleos de las células sensibles. Este efecto no se observó al aumentar la cantidad de SeKT agregada y se detectó muerte celular inmediata (necrosis), con evidencia de fragmentación de la cromatina y pérdida de la integridad de la pared celular. Las células tratadas con TdKT y WaKT no presentan ninguna de las características relacionadas con la inducción de apoptosis. Para definir la posibilidad de la utilización de las toxinas como biocontroladores y evaluar su capacidad de evitar la producción de fenoles volátiles por levaduras contaminantes en vino, se analizó la producción de 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol por Dekkera bruxellensis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia manshurica y Pichia membranifaciens incubadas con SeKT y TdKT. La adición de 4 UA de SeKT en los cultivos mostró una disminución 15 de la producción de fenoles volátiles en porcentajes mayores al 94 % después de 100 días para las cuatro especies contaminantes evaluadas. El agregado de 4 UA de TdKT mostró una disminución de la producción de fenoles volátiles en proporciones que van desde el 30 % en P. membranifaciens hasta el 100 % en P. manshurica. Estos resultados permiten proponer a estas toxinas killer como potenciales agentes antimicrobianos naturales para controlar las levaduras contaminantes presentes durante el envejecimiento y almacenamiento del vino.