Diversidad de levaduras en fruta fina de la Patagonia: selección de potenciales antagonistas de patógenos de poscosecha

Abstract

Las cerezas, frambuesas y zarzamoras se comercializan frescas y se almacenan en frío para extender su vida útil. Un problema de estos productos son las pérdidas en poscosecha causada por mohos. En nuestro país no hay fungicidas registrados para la etapa posterior a la cosecha en estas frutas. Motivo por el cual, el uso de agentes de control biológico (ACB) se propone como un método alternativo para el control de las enfermedades de poscosecha. En este marco, el objetivo general de esta tesis fue generar información sobre los mohos causantes de enfermedades de poscosecha en fruta fina; y seleccionar levaduras indígenas de Patagonia como potenciales ACB para estos patógenos. Para ello se llevó a cabo: 1) Aislamiento e identificación de hongos patógenos y levaduras endo y epifíticas a partir de frutos en condiciones de producción convencional y orgánica; 2) Caracterización y selección de hongos en base a su virulencia, resistencia a fungicida y concentración infectiva mínima (CIM); 3) Selección de levaduras antagonistas por su capacidad biocontroladora en condiciones de conservación de la fruta; 4) Determinación de mecanismos de acción involucrados en la capacidad antagónica de las levaduras seleccionadas; 5) Evaluación de la disponibilidad de agua (aw), temperatura y pH en el crecimiento de las levaduras; 6) Determinación de la concentración efectiva mínima (CEM) de cada aislamiento de levadura. Como resultado se obtuvieron 43 aislamientos de mohos a partir de fruta con síntomas con enfermedad, determinados taxonómicamente en 5 géneros y 9 especies. La caracterización de la virulencia, CIM y resistencia al fungicida iprodione, demostró que Mucor piriformis ccCIEFAP501 y Penicillium crustosum ccCIEFAP491 son aislamientos altamente patogénicos para las frutas finas desde el almacenamiento hasta su comercialización. Ambas especies fueron aisladas de la zona del Paralelo 42°. Se obtuvieron 660 aislamientos de levaduras nativas de cerezas, frambuesas y zarzamoras, a partir de aguas de lavados, utilizando diferentes técnicas y tiempos de conservación de la fruta. Posteriormente, la evaluación de la adaptación al frío demostró que 100 aislamientos fueron capaces de crecer a 0°C (temperatura de almacenamiento de la fruta). A partir de la identificación molecular, las levaduras se distribuyeron en 9 géneros y 20 especies. Se seleccionaron 52 aislamientos de levaduras para evaluar su capacidad antagonista frente a Mucor piriformis ccCIEFAP501 y Penicillium crustosum ccCIEFAP491 en cerezas y 15 aislamientos para ensayos en frambuesas y zarzamoras. Además, se evaluó la eficacia de levaduras de formulación comercial (Yield Plus y Boni Protect) y NPCC1250 Pichia membranifaciens y NPCC1263 Vishniacozyma victoriae, levaduras biocontroladoras de patógenos de pera. Las características de las frambuesas y zarzamoras, pérdida de firmeza y alto nivel de inóculo de patógenos que traen estos frutos del campo, requirieron desarrollar una metodología para la evaluación del potencial biocontrolador de las levaduras sobre la infección natural de mohos. Se determinó también, que las frambuesas y zarzamoras traen una alta carga de inóculo de Botrytis cinerea, capaz de causar el deterioro de la fruta en poscosecha, por lo que se incluyó también en los análisis posteriores. Luego, se seleccionaron los diez aislamientos de levaduras con mayor efecto sobre la virulencia (reduccion del 50% o más) de uno o ambos patógenos en fruta almacenada a 0°C y/o 22°C. La levadura comercial Yield Plus mostró resultados equiparables a los obtenidos con levaduras nativas, mientras que Bony Protect y las levaduras ACB de pera, redujeron la incidencia de los patógenos en menor porcentaje que las nativas (entre 0 - 32%). Se evaluó la posibilidad de mejorar la eficacia de los ACB a través de mezclas de dos levaduras (1:1), pero estas no evidenciaron actividad sinérgica que aumente la efectividad que tienen las levaduras por separado. En cuanto a la determinación de los mecanismos de acción in vitro, vinculados a la actividad antagonista de los diez aislamientos de levaduras, se observó que: Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 y Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fueron las levaduras con una batería de mecanismos de acción más amplia pero no fueron capaces de producir toxinas killer ni de competir por hierro. A partir de estas observaciones se concluyó que estos tres asilamientos presentan mayor potencial ACB, por lo cual se evaluó su comportamiento frente a cambios fisiológicos (temperatura, pH y actividad de agua (aw) y la determinación de la CEM de inóculo de ACB para obtener la mayor efectividad frente a Mucor piriformis, Penicillium crustosum, y B. cinerea. Estos ensayos mostraron que: las tres levaduras tienen mayor crecimiento en la combinación aw x temperatura 0.995 a 20°C y tolerancia a modificación del pH. A. pullulans ccSL1141 fue el que mostró mayor crecimiento a 0° y 5°C. Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fue capaz de crecer en todas las temperaturas, rangos de pH y aw. Las CEM de las tres levaduras se encuentran en concentraciones del orden de 107 cél/mL. Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fue la levadura más efectiva al producir reducción sobre la virulencia de los tres patógenos evaluados. De esta manera esta Tesis aporta: - los primeros registros de la diversidad de hongos y levaduras asociadas a frutas finas de Patagonia, - el primer registro de P. crustosum y M. piriformis como los patógenos más frecuentes, responsables del deterioro de cerezas, frambuesas y zarzamoras en Patagonia, - el primer estudio de la capacidad antagónica de levaduras nativas adaptadas al frío frente a patógenos de poscosecha de interés regional, - la caracterización de diez levaduras nativas adaptadas al frío con capacidad antagonista a través del estudio de los mecanismos de acción en ensayos in vitro, - información relevante para futuros procesos de producción de biomasa a gran escala a través del comportamiento de Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 y Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 frente a cambios fisiológicos y de la CEM para asegurar el efecto antagónico, - el primer registro y caracterización de la especie Cystofilobasidium capitatum como potencial ACB con condiciones para continuar con las etapas de desarrollo de un bioproducto por su capacidad de crecimiento en un amplio rango de temperaturas, pH, aw, espectro de acción más amplio y concentraciones efectivas bajas.