Mecanismos de transporte celular, cinética de acumulación y efectos tóxicos de microcistina-LR en peces patagónicos de agua dulce

Abstract

En este trabajo se estudiaron los mecanismos de transporte a través del epitelio intestinal, la cinética de acumulación y los efectos tóxicos producidos por la cianotoxina microcistina-LR (MCLR), en dos especies de peces patagónicos de importancia económica y ecológica: el pejerrey patagónico (Odontesthes hatcheri) y la trucha arco-iris (Oncorhynchus mykiss), potencialmente expuestos a floraciones de cianobacterias y a sus metabolitos tóxicos. Se evaluó la capacidad de O. hatcheri de digerir cianobacterias y absorber MCLR a través de la administración de células de Microcystis aeruginosa tóxicas (productoras de MCLR) mezcladas con alimento comercial. En este experimento un grupo de peces recibió células de M. aeruginosa previamente rotas por métodos fisicoquímicos (MCLR libre) y otro grupo recibió las células intactas. En los dos casos, O. hatcheri acumuló MCLR en intestino e hígado, en igual proporción entre tratamientos, demostrando que esta especie es capaz de digerir la pared de las cianobacterias y de absorber la MCLR liberada en el tracto digestivo. En un segundo experimento se determinaron los efectos tóxicos provocados por la absorción de MCLR en O. hatcheri. Un tratamiento consistió en administrar células rotas de M. aeruginosa tóxica mezcladas con el alimento comercial; otro grupo de peces recibió alimento comercial mezclado con células rotas de una cepa no tóxica de M. aeruginosa (control de los efectos provocados por otros componentes de las cianobacterias); y el grupo control recibió solamente alimento comercial. La concentración de MCLR administrada de esta forma representó una concentración subletal. Luego de una única alimentación, se estudió en hígado e intestino a lo largo del tiempo: actividad de la enzima proteína fosfatasa 1 (PP1), respuestas de estrés oxidativo (actividad de enzimas catalasa, CAT y glutatión-Stransferasa, GST) y daño oxidativo (peroxidación lipídica). Se determinó la acumulación de MCLR extraíble en metanol (fracción de MCLR acumulada en su forma nativa o conjugada con GSH, o cisteína) y como MCLR unida a proteínas. La fracción extraíble en metanol se cuantificó por ensayo de inhibición de PP1 in vitro (PPIA) y por oxidación de Lemieux-cromatografía gaseosa/espectrometría de masas (CG/EM). La fracción unida a proteínas se cuantificó por oxidación de Lemieux-CG/EM. Los resultados obtenidos indican que MCLR se acumula tanto en intestino como en hígado, mayormente unida a proteínas. La cantidad de toxina acumulada en ambos órganos disminuye a lo largo del tiempo hasta ser prácticamente indetectable a las 48 horas post-intoxicación. En cuanto a los efectos tóxicos, sólo el hígado presentó alteraciones leves. De estos resultados se desprende que O. hatcheri es una especie que puede ser afectada por floraciones de cianobacterias tóxicas aunque esta especie sería capaz de metabolizar y eliminar la toxina acumulada, al menos a concentraciones subletales. Se estudió la participación de proteínas de membrana Abcc (Mrp) (mediadoras de la defensa celular frente a xenobióticos junto con otras proteínas de la superfamilia ABC) en el transporte de MCLR a través del epitelio intestinal. Para esto, se incubaron preparaciones ex vivo de intestino de O. hatcheri y O. mykiss con sustratos específicos de las proteínas Abcc (DNP-SG y calceína) junto con MCLR y se determinaron las tasas específicas de transporte de cada sustrato en presencia de la toxina. Se compararon los resultados obtenidos con MCLR con los efectos provocados por MK571, inhibidor específico de transportadores Abcc. Por otro lado, se evaluaron los efectos tóxicos (actividad PP1, PP2A y GST, concentración de glutatión reducido) producidos por MCLR en segmentos de intestino incubados solamente con MCLR o en conjunto con MK571. Los resultados de estos experimentos indican que los enterocitos de O. mykiss y O. hatcheri son capaces de eliminar la MCLR acumulada hacia el lado luminal (detoxificación) o hacia el lado basolateral (absorción), a través de proteínas tipo Abcc de ubicación apical y basolateral, respectivamente. El intestino de O. hatcheri sería más resistente a la toxina en comparación con el de O. mykiss debido a que en intestino de O. hatcheri no se observó ningún efecto tóxico aún a concentraciones de MCLR más altas que las aplicadas en intestino de O. mykiss. Tampoco se observaron efectos tóxicos al bloquear el transporte por proteínas tipo Abcc con MK571. Por el contrario, en intestino de O. mykiss se observó inhibición de PP1 y 2A (efecto característico de MCLR) en las concentraciones altas de MCLR o a concentraciones bajas pero en presencia de MK571. La causa de la mayor resistencia observada en O. hatcheri aún no está clara y requiere de más estudios. También se evaluaron los efectos de MCLR sobre la composición de glicoconjugados en el tracto intestinal de O. hatcheri. Este estudio se realizó aplicando técnicas de lectina-histoquímica con detección por fluorescencia. Las lectinas utilizadas fueron concanavalina-A, aglutinina de Dolichos biflorus y aglutinina de germen de trigo. Los resultados indican que MCLR afecta la abundancia y distribución de los glicoconjugados marcados, según la sección intestinal que se estudie. Estas alteraciones podrían traer consecuencias a nivel de la digestión y/o en las defensas inmunes frente a patógenos y/o podrían ser evidencia de una respuesta defensiva frente a MCLR. Por último, se aplicaron técnicas de inmunohistoquímica para localizar proteínas ABC en el intestino de O. hatcheri. Utilizando los anticuerpos para transportadores ABC de mamíferos (antiABCB1, ABCC2, ABCC4 y ABCG2) se logró marcar Abcc4 en la membrana basolateral, aunque la marca con este anticuerpo es mucho más fuerte en músculo y Abcg2 se marcó en la región subapical de los enterocitos. No hubo cambios en la localización de la marca de ninguno de estos anticuerpos en respuesta al tratamiento con MCLR.