Regulación transcripcional del metabolismo de poliaminas y el sistema de defensa antioxidante en embriones de Rhinella Arenarum como biomarcador molecular de la exposición a plaguicidas organofosforados

Abstract

La zona del Alto Valle de Rio Negro y Neuquén nuclea el 90% de la producción de peras y manzanas de Argentina. Las labores culturales conllevan la utilización a gran escala de diversos plaguicidas, siendo los organofosforados metilazinfos y clorpirifós los más utilizados en la última década. Sus residuos, además, han sido detectados tanto en suelo como en agua de la región, afectando a los organismos autóctonos como el sapo común Rhinella arenarum, el cual se reproduce y desarrolla en el agua durante la época de aplicación. Por presentar un desarrollo embrionario y larval acuático, un estilo de vida adulto semiacuático, una piel húmeda y sensible y huevos desprotegidos, los anfibios son considerados buenos indicadores biológicos de la salud del medio acuático. Los antecedentes de nuestro grupo de trabajo han demostrado el impacto de los plaguicidas organofosforados sobre el desarrollo de R. arenarum, sus enzimas blanco y detoxificantes, estrés oxidativo y la vía de las poliaminas. Las poliaminas son policationes alifáticos de gran importancia en procesos de desarrollo y crecimiento, y pueden interactuar con diferentes macromoléculas. Sus niveles están finamente regulados por procesos de biosíntesis, de degradación oxidativa y de transporte. En su biosíntesis participan las enzimas ornitina decarboxilasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa, espermidina sintasa y espermina sintasa. En su degradación e interconversión oxidativa participan las enzimas espermina oxidasa, espermidina/espermina N1-acetiltransferasa, acetilpoliamino-oxidasa y diamino oxidasa, las cuales fueron objeto de estudio en esta tesis tanto a nivel de actividad como de expresión. Las reacciones de degradación oxidativa, además, generan especies reactivas del oxígeno y aldehídos reactivos que pueden impactar sobre el sistema de defensa antioxidante. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis consistió en la búsqueda y desarrollo de herramientas moleculares para analizar la expresión de genes involucrados en los procesos mencionados y su regulación mediante factores de transcripción. Para ello, se realizaron exposiciones crónicas y agudas a los plaguicidas organofosforados metilazinfos y clorpirifós. Las exposiciones crónicas se realizaron con embriones desde fertilización hasta completar el desarrollo embrionario. En ellos se evaluaron las actividades de las enzimas degradativas de poliaminas en tres estadios embrionarios, mediante espectrofluorometría. Los tres estadios se corresponden al desarrollo temprano (estadio de brote caudal), intermedio (estadio de boca abierta) y tardío (estadio de opérculo completo) de R. arenarum. Las exposiciones agudas se llevaron a cabo con larvas de 10 días, para analizar la expresión de genes de interés mediante RT-qPCR. No fueron viables los estudios de expresión génica en embriones, debido a la alta variabilidad propia de un organismo en pleno desarrollo. Se pudo observar un incremento de las actividades de diamino oxidasa y acetilpoliamino oxidasa en embriones del estadio temprano, lo que sugiere su utilidad como biomarcadores frente a la exposición de metilazinfos y clorpirifós, respectivamente. Además, se podría decir que estas actividades enzimáticas cumplirían una función protectora frente a los plaguicidas organofosforados. El efecto de ambos plaguicidas sobre la actividad de espermina oxidasa fue evidente en embriones intermedios, y el efecto fue completamente opuesto entre ellos. Se observó un aumento significativo en las concentraciones de putrescina y espermina en embriones intermedios expuestos a metilazinfos, mientras que la exposición a clorpirifós no alteró los niveles de las poliaminas. A través de un análisis de componentes principales, fue posible inferir que los embriones expuestos a metilazinfos presentaban una respuesta proliferativa en estadios tempranos, mientras que los embriones expuestos a clorpirifós presentaban una situación de estrés oxidativo. Mientras que, en estadios tardíos de desarrollo, los embriones expuestos a metilazinfos y clorpirifós mostraron una situación de estrés oxidativo y una alteración del estado proliferativo. Dentro de los estudios moleculares, la tecnología de RNA-Seq es una herramienta altamente sensible y precisa. Esta herramienta permite secuenciar el ARN para medir la expresión génica a través del transcriptoma, en un proceso relativamente accesible desde el punto de vista económico. Resulta ser una tecnología adecuada para organismos no modelo, cuya información genómica no se encuentre disponible como en el caso de R. arenarum. Por lo tanto, el análisis del transcriptoma permitió el avance en los estudios moleculares, analizando la expresión diferencial y diseñando cebadores específicos de la especie para cuantificar la expresión génica por qPCR. Del análisis de la expresión diferencial a partir del transcriptoma de larvas de 10 días, se analizaron posibles genes de referencia y se estableció que los de menor variación son Tubulina A1, B1, B2 y B4B; actina B; gliceraldehído-3-P- deshidrogenasa; L8; y el factor de elongacion-1 EF1A0 y EF1AG. A nivel de enzimas blanco, se determinó que la expresión de acetilcolinesterasa aumenta en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, al igual que el factor de transcripción c-FOS, el cual regularía su inducción. En cuanto a ornitina decarboxilasa 1A, su expresión disminuyó a las 6 h pero aumentó a las 24 h de exposición a ambos plaguicidas. La expresión de S-adenosilmetionina decarboxilasa aumentó en las larvas expuestas a ambos plaguicidas, lo que podría atribuirse a la necesidad de activar el mecanismo de apoptosis para eliminar daño celular. También estaría relacionada al aumento de la expresión del factor de transcripción eIF5A, que es activado por espermidina y participa en el fenómeno de apoptosis. En cuanto al metabolismo oxidativo de las poliaminas, la expresión de acetilpoliamino oxidasa se incrementó en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, mientras que la expresión de espermidina/espermina N1- acetiltransferasa disminuyó. Espermina oxidasa mostró un ligero aumento de la expresión en larvas expuestas a clorpirifós. Finalmente, el tratamiento con plaguicidas organofosforados afectó negativamente la expresión de diamino oxidasa. Dentro de los genes analizados para las enzimas de estrés oxidativo y respuesta antioxidante, sólo se observó una inducción significativa de glutatión peroxidasa 3. El análisis de las respuestas a nivel de transcriptos de las enzimas involucradas en el metabolismo de poliaminas sugiere que la disminución de espermidina/espermina N1-acetil transferasa podría estar relacionada al aumento en la expresión de espermina oxidasa, generando como consecuencia que la cantidad de espermina disponible para ser acetilada esté disminuida. Esto coincidiría con los niveles elevados de S-adenosilmetionina decarboxilasa. Finalmente, los niveles de expresión disminuidos de diamino oxidasa en las muestras expuestas a plaguicidas organofosforados sugieren que la cantidad de putrescina disponible para ser degradada también se encuentra disminuida, indicando que se podría estar generando espermidina como protección frente a la exposición a plaguicidas. Asimismo, a partir del transcriptoma se pudieron obtener secuencias específicas y diseñar cebadores para los genes de: catalasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa, glutatión S-transferasa-pi, glutatión reductasa, ornitina decarboxilasa, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, espermina oxidasa, c- FOS, c-JUN, NRF2, superóxido dismutasa, espermidina sintasa y JNK. Se pudieron amplificar 10 de los pares de cebadores diseñados, y se corroboraron 6 de las secuencias amplificadas (beta-actina, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, c-FOS, c-JUN y ornitina decarboxilasa). Sin embargo, los intentos por estandarizar los cebadores de c-FOS, ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, espermidina sintasa y diamino oxidasa no fueron positivos, ya que estos genes demostraron niveles de transcripción muy bajos en las muestras de larvas de R. arenarum. Sí fue posible analizar la expresión de beta-actina, S-adenosilmetionina decarboxilasa y superóxido dismutasa en exposiciones agudas a 0,5 mg L-1 clorpirifós, los cuales tienden a aumentar su expresión a las 12 h de exposición para luego disminuir a las 24 h. En las muestras expuestas a 1 mg L-1 de clorpirifós, se puede ver una tendencia al aumento continuo en la expresión de beta-actina y S-adenosilmetionina decarboxilasa, mientras que superóxido dismutasa permanece sin cambios. En resumen, determinamos mediante minería de datos que las exposiciones a metilazinfos y clorpirifós generan alteraciones en el metabolismo de poliaminas, en ciertos factores de transcripción y en enzimas blanco, como acetilcolinesterasa. A nivel transcriptómico se puede ver que la exposición a plaguicidas organofosforados induce la expresión de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa y el factor de transcripción eEIF5A, mientras que espermidina/espermina N1-acetiltransferasa y diamino oxidasa disminuyen su expresión. La inducción de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa y S-adenosilmetionina decarboxilasa podría deberse a la necesidad de sintetizar espermidina, la cual induce la expresión del factor de transcripción eEIF5A. Por otra parte, la vía de degradación de las poliaminas genera especies reactivas del oxígeno, al igual que la exposición a plaguicidas organofosforados. Estas especies reactivas de oxígeno inducen, a su vez, la expresión del factor de transcripción c-FOS, el cual también produciría un aumento de la expresión de acetilcolinesterasa.