Control biológico de hongos patógenos de peras en postcosecha utilizando levaduras indígenas en la Nor-Patagonia

Abstract

El Alto Valle de Río Negro y Neuquén constituye la principal área productora y exportadora de peras de Argentina. Las variedades más importantes destinadas a la exportación son Beurrè D ́Anjou y Packham ́s Triumph, las cuales se almacenan en cámaras frigoríficas (-1/0°C y 95%HR) entre 3 y 7 meses. Durante este período, se producen importantes pérdidas por Penicilium sp. y Botrytis cinerea. El desarrollo de cepas resistentes de estos hongos por el uso intensivo de fungicidas químicos, el incremento de la demanda de alimentos inocuos y la implementación del manejo orgánico e integrado de plagas, requieren de prácticas sustentables para el control de estos patógenos. El control biológico con levaduras es una de las alternativas más promisorias. En esta Tesis se propone un sistema de biocontrol basado en el uso de dos levaduras nativas de la Norpatagonia, seleccionadas in situ para el control de las principales enfermedades fúngicas de postcosecha de pera. Los antagonistas seleccionados fueron Pichia membranifaciens NPCC 1250 y Cryptococcus victoriae NPCC 1263, los cuales fueron aislados y seleccionados por enfrentamientos in situ en fruta, en condiciones de almacenamiento frigorífico, frente a aislamientos locales de P. expansum y B. cinerea seleccionados por su patogenicidad. La estrategia de aislamiento y selección empleada supera a las propuestas planteadas hasta el momento en bibliografía. Las dos levaduras, fueron aisladas a partir de aguas de lavado obtenidas de heridas sanas de fruta orgánica y de transición del cultivar Packham ́s Triumph, luego de 6 meses de almacenamiento frigorífico bajo presión natural de inóculo. Las aguas de lavado conteniendo una mezcla de levaduras se enfrentaron a P. expansum en fruta, se incubaron a 4°C durante 60 días (screening primario), y a partir de las heridas sanas se aislaron en agar-jugo de pera, para finalmente evaluarlas individualmente frente a ambos patógenos (screening secundario) en frutos en condiciones de almacenamiento comercial. Se aislaron 11 especies de levaduras, con predomino de los géneros Aureobasidium, Cryptococcus y Rhodotorula. En general, las especies identificadas correspondieron a levaduras psicrófitas, característica fundamental para el potencial uso en la postcosecha. Se evaluaron los mecanismos antagónicos de cinco aislamientos preseleccionados por su capacidad biocontroladora, en ensayos in vitro e in situ. Las dos levaduras finalmente seleccionadas se caracterizaron por su capacidad de producir toxinas killer frente a los dos patógenos postcosecha; secretar enzimas hidrolíticas de pared (quitinasas, glucanasas y proteasas) a -1/0°C; sobrevivir y colonizar las heridas hasta los 120 días de almacenamiento en frío y competir por diferentes nutrientes. In situ, P. membranifaciens NPCC 1250 mostró un crecimiento poblacional de 5,2905 lnUFC/herida con una fase lag de 2,7 días, mientras que Cr. victoriae NPCC 1263 alcanzó 5,8984 lnUFC/herida y 0,76 días de fase lag. Los dos aislamientos compitieron por ácido aspártico y NH 4 NO 3 frente a P. expansum; mientras que solo Cr. victoriae NPCC 1263 compitió por glicina. Esta última se destacó además por su capacidad de producir biofilms in vitro. Se evaluaron distintas estrategias de mejoramiento del biocontrol in situ, en condiciones de conservación: incremento de la concentración de células, combinación de las dos levaduras y adición de diferentes compuestos (glucosa, NH 4 Mo 7 O 24 y CaCl 2 ). La combinación con CaCl 2 (2% p/v) logró mejorar la capacidad antagonista de las levaduras. Finalmente, los estudios sobre patogenicidad (crecimiento a 37°C, producción de fosfolipasas y crecimiento en condiciones similares a las del estómago) resultaron negativos para las dos levaduras. La producción de biomasa para los experimentos a escala semicomercial, se realizó en un reactor de tanque agitado de 22L, utilizando melaza de caña de azúcar (128,2 g/L) y murea (0,6 g/L). La recolección de las células se realizó en fase estacionaria entre las 40- 60 h, con rendimientos de 2,5x10 13 UFC/mL para P. membranifaciens NPCC 1250 y 5,75x10 12 UFC/mL para Cr. victoriae NPCC 1263. Las células de las levaduras se mantuvieron en agua destilada estéril a 4oC por 50 días sin pérdidas significativas de la viabilidad. A escala semicomercial, las levaduras se aplicaron por pulverización en línea en dos empaques (A y B) sobre pera orgánica Beurrè D ́Anjou (solo en B) y Packham ́s Triumph (A y B) y la fruta fue almacenada en frío 3 y 5 meses, respectivamente. Sobre 400 Kg de fruta se aplicaron 25L de una solución de 10 11 UFC/mL de levaduras solas o combinadas con CaCl 2 (2% p/v). En peras Beurrè D ́Anjou, en B, a los 3 meses de conservación las levaduras con CaCl 2 redujeron significativamente la incidencia de P. expansum (63,7% de control con P. membranifaciens NPCC 1250 y 68,2% con Cr. victoriae NPCC 1263). La combinación con Cr. victoriae NPCC 1263 controló totalmente a B. cinerea; mientras que con P. membranifaciens NPCC 1250 controló 87,8% de esta enfermedad. El nivel poblacional alcanzado por Cr. victoriae NPCC 1263 fue de 4,5x10 8 UFC/cm 2 de fruto, mientras que P. membranifaciens NPCC 1250 7,94x10 7 UFC/cm 2 de fruto. El agregado de CaCl 2 no mejoró la capacidad de colonización de las levaduras sobre el fruto. Sobre Packham`s Triumph, en el empaque A, los tratamientos redujeron entre 50 y 100% la incidencia de los dos patógenos con respecto al control, luego de 5 meses de conservación. Cr. victoriae NPCC 1263 con CaCl 2 controló totalmente la incidencia de ambos patógenos; mientras que P. membranifaciens NPCC 1250 sola o combinada entre 77 y 86%. En B, nuevamente los mejores resultados se obtuvieron de la combinación de Cr. victorieae NPCC 1263 con CaCl 2 , que controló a ambos patógenos en un 63%; P. membranifaciens NPCC 1250 sola redujo la incidencia de P. expansum en un 55,7% y 49% la de B. cinerea. El nivel poblacional promedio alcanzado por Cr. victoriae NPCC 1263 a los 5 meses de conservación fue de 10 8 UFC/cm 2 de fruto, mientras que P. membranifaciens NPCC 1250 10 7 UFC/cm 2 de fruto. El agregado de CaCl 2 no mejoró la capacidad de colonización de las levaduras sobre el fruto. Estos resultados son alentadores, ya que mediante el uso de esta tecnología inocua se reduce significativamente la incidencia de las enfermedades postcosecha de peras, lo cual repercute directamente en los parámetros económicos de la actividad. Finalmente, los aislamientos P. membranifaciens NPCC 1250 y Cr. victoriae NPCC 1263, forman parte de la patente de invención “Cepas de levaduras para el biocontrol de frutas postcosecha, composiciones que las contienen, métodos de aplicación de las composiciones y usos” otorgada por el Instituto Nacional de la Propiedad Industrial, Administración Nacional de Patentes (INPI. No: 20120101053).